Ученые объяснили связь между диабетом и инфекцией мочевыводящих путей

Сахарный диабет (СД) — глобальная проблема здравоохранения: он сопровождается повышенным риском бактериальных инфекций. В частности, распространены инфекции мочевыводящих путей (ИМП), вызванные E. coli, которые приводят к уросептицемии.

Традиционно считается, что глюкозурия обеспечивает оптимальные условия окружающей среды для роста бактерий. Но несколько факторов, таких как возраст, невропатия с неполным опорожнением мочевого пузыря, а также диабетическая нефропатия, повышают риск ИМП.

Снижение миграции и хемотаксис лейкоцитов, играют роль в патогенезе тяжелой ИМП у больных СД.

Защитить мочевой пузырь от патогенных микроорганизмов могут несколько факторов, и один из них — антимикробные пептиды. Они экспрессируются эпителиальными и эндотелиальными клетками и нейтрофилами.

Антимикробный пептид псориазин, кодируемый S100A7, — член семейства белков S100, обнаруженный в мочевыводящих путях. Он известен высокой антибактериальной активностью против E. coli, но его при диабете и при высоком уровне глюкозы еще не известна.

Кого исследовали и что определяли

В исследовании участвовало 36 пациентов с СД и 20 человек без СД (контрольная группа). Используя мочу, клетки мочевого пузыря и образцы сыворотки крови пациентов, исследователи проанализировали уровни псориазина и других пептидов (S100A7, DEFB4A и RNASE7, CAMP, DEFB1 и DEFB103A), необходимых для того, чтобы слизистая оболочка мочевого пузыря оставалась неповрежденной и защищала от инфекции.

Ученые добавляли 50 мкл бактериальной суспензии с концентрацией 10 4 КОЕ/мл к 150 мкл мочи с 5 мкМ пептида псориазина. После инкубации в течение 30 минут при 37°C высевали и определяли выживаемость бактерий путем подсчета жизнеспособных микроорганизмов. 

После необходимой инкубации уроэпителиальные клетки человека обрабатывали непосредственно для выделения РНК, а ткани мочевого пузыря гомогенизировали вручную с помощью гомогенизатора Даунса.

Суммарную РНК выделяли с использованием набора RNeasy Mini (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Концентрацию и чистоту РНК определяли с помощью нанокапли, а до 0,5 мкг РНК подвергали обратной транскрипции с использованием случайных праймеров в течение 10 мин при 25 °С, 120 мин при 37 °С.

Затем результаты были проверены на мышах и клетках мочевого пузыря с инфекцией и без нее.

Результаты исследования

Возможное влияние высокого уровня глюкозы на антимикробные пептиды было проанализировано в уроэпителиальных клетках человека.

Гипергликемия привела к значительно более низкой экспрессии S100A7, DEFB4A и RNASE7, в то время как CAMP, DEFB1 и DEFB103A остались неизменными по сравнению с низким уровнем глюкозы.

Поскольку ранее было показано, что DEFB4A 16 и RNASE7 скомпрометированы высоким уровнем глюкозы, ученые сосредоточились на S100A7 — псориазине.

Чтобы обеспечить клиническую значимость, ученые исследовали уровни псориазина у пациентов с диабетом. У этих пациентов наблюдалось снижение экспрессии мРНК S100A7 в уроэпителиальных клетках (рисунок 1a), а также более низкие уровни белка псориазина в моче (рисунок 1b) с аналогичной тенденцией уровней псориазина в сыворотке по сравнению с контрольной группой без диабета (рисунок 1c).

Рис. 1

Для исследования возможного влияния глюкозы и инсулина на псориазин использовали гипергликемические и эугликемические гиперинсулинемические зажимы (клэмп-тесты). 

Техника глюкозного зажима — метод количественной оценки секреции и резистентности к инсулину.

Эугликемический гиперинсулинемический клэмп применяют для определения инсулинорезистентности с конца 70-х гг. Сущность метода — острое повышение концентрации инсулина в крови до 100 МЕ/л путем инфузии инсулина со скоростью 1 МЕ/мин на 1 кг и одновременное внутривенном введении глюкозы для поддержания эугликемии (~5,5 ммоль/л).

Гипергликемические зажимы устанавливали лицам с предиабетом и высоким риском развития СД 2 типа. В этих исследованиях инфузия глюкозы в течение 2 часов приводила к повышению медианы уровня глюкозы в плазме с 5,4 (диапазон 4,6–6,4) ммоль до 11,4 ммоль (диапазон 10,8–12,5).

Это стимулировало секрецию инсулина, увеличивая средний уровень инсулина в плазме с 16,1 (диапазон 8,4-74,2) мЕд/л до 95,2 (диапазон 35,6-160,0) мЕд/л.

Эти изменения сопровождались снижением уровня псориазина (рисунок 2a). Напротив, эугликемические гиперинсулинемические зажимы у пациентов с СД 1 типа и у лиц без диабета не показали различий в уровнях псориазина в плазме (рисунок 2b).

Следовательно, более низкий уровень псориазиновой активности в плазме был связан с повышенным уровнем глюкозы в крови, но не с уровнем инсулина.

Рис. 2a

Рис. 2b

Чтобы подтвердить результаты in vivo, ученые изучили самок мышей с СД 2 типа и без диабета. Уровни мРНК S100a7a и белка псориазина были значительно ниже в мочевом пузыре мышей с диабетом, при этом пептид преимущественно локализовался в поверхностных слоях зонтичных клеток.

Для дальнейшего исследования влияния псориазина на инфекцию при диабете мышей трансуретрально инфицировали E. coli. Ученые наблюдали более низкую экспрессию S100a7a на мРНК и уровни белка через 24 часа и 7 дней после заражения в мочевых пузырях мышей с СД по сравнению с контрольными мышами.

Точно так же уроэпителиальные клетки, культивируемые в условиях нормогликемии, показали быстрое увеличение мРНК S100A7, достигающее пика уже через 15 минут после заражения E. coli.

С другой стороны, клетки, культивированные при высоком уровне глюкозы, экспрессировали более низкую концентрацию мРНК S100A7.

Выводы

• Исследование показало, что высокие уровни глюкозы скомпрометировали врожденный иммунный ответ и нарушили целостность эпителия.
• Эти результаты могут служить объяснением клинического наблюдения, согласно которому пациенты с плохо контролируемым диабетом имеют более высокий риск рецидива ИМП, острого пиелонефрита и уросептицемии.
• Инсулин не оказывает никакого влияния на псориазин: можно заключить, что псориазин регулируется другим путем.
• Псориазин — важный антимикробный пептид в бактериальном клиренсе мочевыводящих путей при диабете. Он может стать потенциальной мишенью для новых терапевтических препаратов.